Kloning Gen C1 (Rep) Geminivirus ke dalam Escherichia coli BL21

ELLY, SYAFRIANI (2016) Kloning Gen C1 (Rep) Geminivirus ke dalam Escherichia coli BL21. Diploma thesis, Universitas Andalas.

Text (Skripsi Fulltext) 2186.pdf - Published Version Restricted to Repository staff only Download (4MB)

Abstract

Sayuran merupakan salah satu komoditi yang berperan penting dalam menunjang perekonomian Sumatera Barat. Salah satu jenis komoditi sayuran tersebut adalah cabai merah. Cabai merah mempunyai nilai ekonomi yang penting dibandingkan dengan jenis sayuran lainnya (Arneti et al., 2009). Sumatera Barat merupakan salah satu provinsi penghasil cabai di Indonesia. Produksi cabai di Sumatera Barat sangat fluktuatif dan masih jauh dari potensi yang dapat dihasilkannya. Salah satu penyebabnya ialah adanya serangan hama dan penyakit. Penyakit yang paling dominan dan sangat merugikan tanaman cabai merah pada saat sekarang ini adalah penyakit kuning keriting. Penyakit ini disebabkan oleh Geminivirus dan disebut dengan Pepper Yellow Leaf Curl Virus (PepYLCV) (genus: Begomovirus; famili: Geminiviridae). Di Sumatera Barat gejala penyakit ini dilaporkan pertama kali pada akhir tahun 2003 di Kabupaten Sawah Lunto, Sijunjung dan pada tahun 2004 telah menyebar di seluruh areal pertanaman cabai di Sumatera Barat (Syaiful, 2005). Para pemulia tanaman saat ini berusaha untuk mengembangkan kultivarkultivar tahan terhadap Geminivirus baik melalui pendekatan konvensional maupun pendekatan rekayasa genetik. Pendekatan pemuliaan konvensional belum memberikan peranan yang berarti terhadap penanganan penyakit kuning keriting karena spesies-spesies cabai yang diketahui memiliki ketahanan terhadap penyakit kuning keriting belum teridentifikasi sampai saat ini. Seiring dengan hal tersebut maka pendekatan pemuliaan nonkonvensional dengan menggunakan teknik rekayasa genetik juga dilakukan secara intensif (Gonsalves, 2002). Strategi rekayasa genetik memiliki dua pendekatan dalam pengembangan kultivar resisten terhadap virus berdasarkan sumber gen yang digunakan. Pendekatan pertama disebut dengan pendekatan Pathogen Derived Resistance (PDR) dimana gen yang digunakan untuk menghasilkan ketahanan berasal dari patogen virus itu sendiri (Sanford dan Johnston, 1985). Pada pendekatan kedua, gen-gen yang digunakan dapat berasal dari inang ataupun organisme lainnya (Margareta, 2004). Strategi berbasis PDR dapat dibagi ke dalam beberapa kelompok tergantung kepada bagian genom virus yang digunakan. Salah satu gen yang dapat digunakan untuk menghasilkan resistensi berbasis PDR adalah penggunaan gen-gen yang mengkode protein untuk replikasi (gen replikasi) (Palukaitis dan Zaitlin, 1997). Pada Geminivirus, gen yang berperan sebagai gen replikasinya ialah gen C1 (Desbiez et al., 1995; Hull, 2002). Pemanfaatan gen C1 (Rep) di dalam PDR telah dilakukan oleh Golemboski et al. (1990) pada tanaman tembakau untuk merakit kultivar tembakau yang tahan terhadap Tobacco Mosaic Virus (TMV). Ketahanan yang serupa juga telah dikembangkan untuk beberapa jenis virus lainnya seperti Pea Early Browning Virus, PVY, dan CMV. Konsep penggunaan gen dari gen Rep yang telah digunakan untuk pembentukan ketahanan pada tanaman, dapat terdiri dari penggunaan sekuens gen sepenuhnya dan adanya pemotongan atau mutasi pada gen tersebut. Kebanyakan dari sifat ketahanan yang telah diperoleh pada hasil percobaan, tidak membutuhkan sintesis protein dan menjadi perantara pada level RNA. Jenis ketahanan ini memiliki keterbatasan hanya untuk spektrum serangan virus yang sempit. Spektrumnya lebih sempit daripada Coat Protein Mediated Resistance (CPMR). Untuk membuat spektrum ketahanannya menjadi luas merupakan hal yang sangat penting dilakukan. Hal ini dilakukan untuk memperbanyak gen Rep tersebut dari beberapa sumber virus yang berbeda ke dalam genom tanaman yang dicobakan. Walau spektrum gen Rep sempit, tetapi sifat ketahanan yang dihasilkannya sangat kuat. Serangan virus dengan tingkat agresivitas yang sangat tinggi, tidak akan memberi pengaruh terhadap tanaman transgenik yang memiliki ketahanan dari gen Rep (Dasgupta et al., 2003). Langkah awal dalam tahapan perakitan kultivar cabai merah tahan Geminivirus melalui pendekatan PDR dapat dilakukan dengan mengkloning gen target ke dalam plasmid yang diperbanyak di dalam vektor perbanyakan seperti bakteri Escherichia coli BL21. Bakteri Escherichia coli BL21 memiliki keunggulan untuk kloning gen dibandingkan bakteri Escherichia coli (E. coli) strain lainnya. E. coli BL21 memiliki kemampuan memperbanyak diri dalam jumlah rendah (low copy number) tetapi memperlihatkan ekspresi yang lebih baik untuk tujuan transformasi gen/DNA daripada bakteri E. coli lainnya (Nellen, 2011). Selain itu, E. coli BL21 juga memiliki ketahanan terhadap antibiotik chloramphenicol sehingga memudahkan seleksi bakteri E. coli BL21 transforman di media selektif. Kloning gen target sebagai langkah awal perakitan kultivar cabai merah tahan geminivirus sangat penting untuk stok gen dan memudahkan proses ligasi gen target ke dalam plasmid yang akan digunakan untuk proses transformasi serta diharapkan dapat terekspresi dengan baik di dalam tanaman. Adapun plasmid yang dapat mengekspresikan gen target dengan baik di dalam tanaman ialah plasmid pBI121, pBin19, pET-15b, dan masih banyak plasmid komersial lainnya yang biasa digunakan untuk proses transformasi genetik ke dalam tanaman. Namun kekurangan plasmid-plasmid ini ialah biasanya memiliki ujung lengket (sticky end) setelah dipotong dengan enzim restriksi, sedangkan gen target biasanya berujung tumpul (blunt end) (Brown, 1991). Sehingga perlu dilakukan penambahan adaptor pada proses ligasi gen target ke dalam plasmid tersebut. Untuk memudahkan ligasi gen target ke dalam plasmid yang dapat terekspresi di dalam tanaman, maka perlu dilakukan ligasi gen target ke dalam plasmid pGem-T easy terlebih dahulu, karena ujung basanya telah diketahui pasti yaitu basa T (Timin) dengan gen target hasil amplifikasi (PCR) yang ujung basanya sudah pasti A (Adenin). Sehingga persentase keberhasilan ligasi gen target ke dalam plasmid pGem-T easy lebih tinggi dibandingkan plasmid-plasmid lainnya. Berdasarkan uraian di atas, peneliti tertarik dan telah melakukan penelitian yang berjudul, “Kloning Gen C1 (Rep) Geminivirus ke dalamEscherichia coli BL21”, sebagai langkah awal terhadap upaya perakitan kultivar cabai merah yang resisten terhadap serangan penyakit Geminivirus melalui pendekatan PDR.

Actions (login required)

View Item